Skip to content

radom szpital na tochtermana cd

3 tygodnie ago

556 words

Miana wirusów mieściły się w zakresie od 2 x 105 do 2 x 106 opornych na G418 jednostek tworzących kolonie na mililitr na komórkach NIH / 3T3. Przeprowadzono liczne testy supernatantu retrowirusowego, w tym testy sterylności dla bakterii tlenowych i beztlenowych oraz mykoplazm, testy MAP, testy na obecność limfocytowego wirusa zapalenia opon mózgowo-naczyniowych i test S + L- dla wirusów ekotropowych, ksenotropowych i amfotropowych po amplifikacji 3T316 dla wirusa pomocniczego . Przeprowadzono również ogólne testy bezpieczeństwa u myszy i świnek morskich, zgodnie z wymaganiami FDA. Gdy całkowita liczba komórek w hodowlach TIL osiągnęła 1,2 do 7,6 x 108 komórek, jedną trzecią do połowy komórek eksponowano na supernatant LNL6 przy wielości infekcji (stosunek wirionów do komórek) 1,3 do 2,3 w obecność 5 .g protaminy20 na mililitr roztworu w 800-ml kolbach do hodowli tkankowych zawierających 200 ml na kolbę; komórki inkubowano w 37 ° C przez dwie godziny. Następnie przemyto je i umieszczono w hodowli o gęstości 106 komórek na mililitr. Następnego dnia powtórzono procedurę transdukcji. Wskaźnik odzysku TIL po transdukcjach wahał się od 74 do 100 procent.
Testy TI z transdukcją i nietransdukcją
Przed infuzją TIL hodowle scharakteryzowano na podstawie ich ekspresji markerów na powierzchni komórki za pomocą cytometrii przepływowej i zgodnie z ich właściwościami litycznymi wobec autologicznych guzów, allogenicznych guzów oraz docelowych linii komórkowych K562 i Daudi przez czterogodzinne chromowanie. Testy uwalniania 51, jak opisano gdzie indziej.34 5 Transdukowane komórki testowano pod kątem obecności wirusa pomocniczego za pomocą testu S + L- (w tym jedno-trzytygodniowej amplifikacji 3T3), w obecności koperty 4070A. geny w teście łańcuchowej reakcji polimerazy i na obecność odwrotnej transkryptazy.15, 16, 21, 22 Standardowy test limuzyjny został wykorzystany do przetestowania endotoksyny, a testy do autonomicznego wzrostu TIL zostały przeprowadzone przez usunięcie interleukiny- 2 i po hodowli komórkowej przez co najmniej jeden miesiąc. Przeprowadzono testy Southern blot, jak również testy fosfotransferazy neomycyny, produktu genu bakteryjnego, w celu potwierdzenia obecności i ekspresji genu NeoR.
Ocena testu DNA i reakcji łańcuchowej polimerazy
Genomowy DNA izolowano z hodowanych TIL, jednojądrzastych komórek krwi obwodowej lub próbek z biopsji guza od pacjentów po inkubowaniu komórek w 55 ° C przez dwie godziny z proteinazą K (200 ug na mililitr roztworu) w 10 mM TRIS Kwas solny (pH 8,0) i 1% dodecylosiarczanu sodu (SDS), a następnie ekstrakcja fenolem i strącanie etanolem 12, 13
Aby wykonać testy Southern blot, 15 .g próbek całkowitego komórkowego DNA strawiono do końca enzymem restrykcyjnym Sstl i poddano elektroforezie w 0,8% żelach agarozowych, a następnie denaturowano, neutralizowano i przeniesiono na błony nylonowe w 10 × SSC (1 x SSC = 0,15 M chlorek sodu i 0,015 M cytrynian trisodowy). Hybrydyzację z znakowanymi 32P sondami przeprowadzono jak opisano poniżej dla testu reakcji łańcuchowej polimerazy.
Mieszanina reakcji łańcuchowej polimerazy zawierała 2 .g genomowego DNA w całkowitej objętości 100 .l, zawierającej 70 mM kwas TRIS-kwas solny (pH 8,8); 20 mM siarczanu amonu; 6 mM ditiotreitolu; 100 .g albuminy surowicy bydlęcej na mililitr; 2 mM chlorek magnezu (do amplifikacji genu NeoR) lub 4 mM chlorek magnezu (do amplifikacji ludzkiego genu beta-globiny stosowanego jako kontrola wewnętrzna dla pojedynczych kopii sekwencji genomowych); 500 .M każdego trifosforanu deoksyadenozyny, trifosforanu deoksycytydyny, trifosforanu deoksyguanozyny i trójfosforanu deoksytymidyny; 10 procent dimetylosulfotlenku; 100 pmol każdego podkładu; i 4 jednostki termostabilnej polimerazy DNA Tag (New England Bio-labs) .13, 14 Próbki zostały pokryte 50 .l oleju mineralnego, aby zapobiec parowaniu
[przypisy: ołówkowaty stolec, wyprysk pieniążkowaty, pcuz polkowice ]

0 thoughts on “radom szpital na tochtermana cd”